| 經濟林木基因轉化技術 劉占德(陝西省農科院信息所) |
基因轉化技術是利用基因工程方法改良植物性狀最基本的手段和途徑。目前經濟林木常見的轉化方法有農杆菌介導法（agrolbacterium-mediated）、生物彈射擊法（biolistic system）和DNA直接攝取法（direct DNA uptake）等。 1、農杆菌介導基因轉化 目前已探討的各種基因轉化方法中，農杆菌介導轉化是研究最清楚的一種。10余種經濟林木基因轉化研究取得成功，其大多數採用農杆菌介導轉化法。這是因為： 農杆菌侵染的主要對象是雙子葉植物； 由Horsch建立葉盤法農杆菌介導培養轉化體系以來，農杆菌介導的遺傳轉化基因無需以原生體作為目的基因的受體而使其操作簡便易行，從而得到廣泛應用。 這種方法是利用農杆菌 包括根癌農杆菌（agrobacterium tumefaciens）和髮根農杆菌（A.rhizogines）」作為中間介體，受傷的植物細胞被農杆菌感染後，農杆菌攜帶的質粒DNA片段稱為轉移DNA（Transfer DNA，T-DNA），會插入到寄主細胞的核基因組中，從而實現基因轉化。Fralely-R．T等首先在煙草上利用農杆菌介導技術成功地獲得了轉基因植株，隨後這種方法迅速在多種植物上得到了廣泛的應用。農杆菌的主要侵染對象是雙子葉植物，單子葉植物對農杆菌一般不太敏感，但最近也有不少感染致病的報導。絕大多數經濟林木對農杆菌比較敏感，因此農杆菌介導技術便成為經濟林木基因轉化的主要手段。Mcgranahan-GH等用核桃無性胚接種帶有PCGN200′594質粒的農杆菌，得到了第一個來自無性胚的轉基因植株；Scorza-R等用帶有複合質粒的農杆菌6044接種桃葉片和胚愈傷組織，得到了轉基因植株；Mante-S等用李的下胚軸切片，接種帶有PCGH7001或PCGH7314質粒的農杆菌，得到了轉基因李植株；新西蘭從一種小果實的紅肉獼猴桃中分離，提取出控制紅肉的基因，然後用農杆菌介導法轉移到大果獼猴桃品種中，現已得到一個果重70g以上的紅肉獼猴桃，這是世界上第一個有實用價值的轉基因經濟林木。除此之外，目前利用該方法還在蘋果、葡萄、扁桃、杏、樹莓、黑茶子、美洲山核桃、柑桔、芒果、雜交山楊、桉樹、日本柿、番木瓜、橡膠樹等經濟林木中獲得轉基因植株。 應用農杆菌介導法的前提條件為： 具有對轉化植物敏感的去除致癌區DNA（T-DNA）並攜帶外源基因的農杆菌工程菌種； 具有方便可行的篩選轉化細胞的選擇標記基因； 理想的植物受體材料。為此，近年來基因轉化技術研究的重點為如何建立和完善再生體系和提高基因轉化頻率，其中較為集中研究的方面有： 提高農杆菌侵染力。Dandekar等在蘋果上研究發現，不同農杆菌株系致病能力差異很大。而農杆菌對寄主細胞的致病力主要受其攜帶的原質粒上的Vir區的6組基因（VirA、B、C、D、E、G）控制。篩選適宜的菌種對提高目標植物的轉化成功率至關重要。研究者還發現，一些生理生化因素，如乙酸丁香酮（ace－tosyingone）、甜菜堿（betaine phosphate）、PH、溫度、滲透壓等通過調節Vir區基因來影響農杆菌致病力。 選擇最佳受體材料。理想的受體材料其細胞既能與農杆菌直接接觸，又能由單細胞分化再生植株。目前常用的外植體有葉片、莖段、原生質體、下胚軸、無性胚等，而以葉片應用最為廣泛。 適宜的誘導和選擇條件。篩選劑種類、篩選劑濃度、篩選時間、培養基基質等都會影響到轉基因細胞的分化和再生植株。 2、生物彈射擊基因轉化 生物彈射擊法（Biolistic System），又稱“基因槍”法（Gene gun bombardment），也稱粒子轟擊法（Particle bombardment）或高速粒子微噴射技術（Hight velocityparticle microprojection），是一種機械轉移基因的方法。採用加入Ca2+的亞精胺等使外源DNA吸附在鎢金微粒表面，制成DNA—微彈，在基因槍激發的瞬間力量作用下，將外源基因直接導入植物細胞中。 生物彈射擊法基因轉化的最突出的優點是其應用的廣泛性。這種方法將來可能成為一種“萬能”基因轉化法。它和農杆菌介導法不同之處在于它不只限于某些植物，而排斥另一些植物。在生物彈射擊法發明（1987，Sanford）後的短短幾年內，該法已成功地應用于高等植物（被子植物和裸子植物）、藍藻、細菌、真菌、動物離體細胞和活體細胞組織。該法另一個優點是將外源DNA可以直接導入可再生的組織或細胞，因此不需要培養原生質體。 生物彈射擊法已在多種植物上應用成功，經濟林木上僅在番木瓜（Carica papaya）、蔓越桔（Veccinnim macrocarpa）上獲得轉基因植株。此外，Hebert等用包裹質粒的鎢粒子轟擊葡萄品種的細胞懸浮系，獲得了轉化的愈傷組織。Ye-XJ等以桃胚胎愈傷組織為受體進行粒子轟擊，獲得Gus（β-glucuronidase）基因表達。 生物彈射擊基因轉化由于受轟擊速度、靶細胞距離、微彈直徑、速度、射擊的擴散半徑、外源DNA的量及其結構等諸因素的影響，存在著價格昂貴、嵌合體不易排除、不易選擇轉化體、轉化頻率低等困難和問題使其在實踐應用中受到一定的限制。 3、DNA直接攝取法 該法是將植物原生質體和外源DNA共同培養，通過一種化學或物理處理，使DNA直接進入植物細胞並得以轉化和基因表達。常見的有聚乙二醇法（PEG法）、電場誘導法（electroperation）等。由于經濟林木獲得原生質體再生植株較為困難，而原生質體再生植株細胞變異頻率極高因素的限制，目前此法在經濟林上應用較少。 [資料來源：基因轉化技術在經濟林木遺傳改良上的應用/劉占德(陝西省農科院信息所)//西北林學院學報 |